Gavin Virginia
Geregistreerd op: 22 Jun 2020
Berichten: 3
|
 Geplaatst: 22-06-2020 03:33:07 Onderwerp: puma basket |
 |
|
|
ÿþRationalisiert durch puma basket unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA coexprimieren und mit PUMA interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre Lokalisation von PUMA regulieren könnte. Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar U87MG-EGFRvIII und U87MG-Vektorzellen. Die mitochondriale Fraktionierung / Western Blot (Fig. 5a) zeigte, dass PUMA hauptsächlich in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht gestressten Bedingungen lokalisiert war und nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und eine bescheidene mitochondriale Translokalisierung durchlief Anisomycin (AN).
Lamin B: Kernprotein. ME: Mitochondrienextrakte. NME: nicht mitochondriale Extrakte. (D) PUMA wird im Zytoplasma von EGFR-exprimierenden menschlichen Brustkrebszellen sequestriert. MDA-MB-468-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Mengen an endogenem EGFR exprimieren [34], wurden mit puma schuhe herren und ohne Staurosporin behandelt, in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert und Proteinextrakte wie zuvor beschrieben analysiert. PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter nicht gestressten und gestressten Bedingungen lokalisiert, wie durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt.
6a (linkes Feld) zeigt, dass die Fähigkeit puma baskets von EGFR, an PUMA zu binden, in U87MG-EGFR-Zellen mit und ohne EGF-Stimulation nach Serummangel ähnlich war. Wie durch das Fehlen von autophosphoryliertem EGFR (p-EGFR, Y1068) angezeigt, exprimieren serumverarmte U87MG-EGFR-Zellen inaktives EGFR (Fig. 6a-rechts). Im Gegensatz dazu ist p-EGFR in EGF-behandelten Zellen leicht nachzuweisen, was darauf hinweist, dass EGF EGFR in diesen Zellen effizient aktiviert. Um weiter zu bestimmen, ob EGFR-Kinaseaktivität für die EGFR-PUMA-Wechselwirkung erforderlich ist, behandelten wir U87MG-EGFR-Zellen mit einem niedermolekularen EGFR-Kinase-Inhibitor, Iressa, der klinisch zur Hemmung der EGFR-Aktivität verwendet wird.
Wie in Fig. 6b (linkes Feld) gezeigt, veränderte puma future Iressa die EGFR-Bindung an PUMA nicht, reduzierte jedoch erwartungsgemäß das Ausmaß der EGFR-Autophosphorylierung / -Aktivierung signifikant. Die Wechselwirkung zwischen EGFR und PUMA ist unabhängig von der ligandenvermittelten Rezeptoraktivierung und ist es auch unter EGFR-Hemmung aufrechterhalten. (A) Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung erfolgt unabhängig von der ligandenvermittelten Rezeptoraktivierung. U87MG-EGFR-Zellen wurden 24 Stunden lang an Serum gehungert und 20 Minuten lang mit EGF stimuliert. Die Zellen wurden geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechtes Feld) unterzogen. Ein EGFR-Antikörper wurde verwendet, um EGFR zu immunpräzipitieren.
6b zeigt an, dass die Iressa-Behandlung die Wechselwirkung zwischen EGFR / EGFRvIII und PUMA nicht signifikant beeinflusste. Wir nehmen an, dass der EGFR / EGFRvIII-vermittelte Antagonismus der PUMA-vermittelten intrinsischen Apoptose zur GBM-Resistenz gegen EGFR-gezielte Therapie beiträgt und die intrinsische Apoptose durch Hemmung wiederherstellt Bcl-2 / Bcl-xL kann diese Zellen für eine EGFR-gezielte Therapie sensibilisieren. Daher behandelten wir U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-Zellen mit einem Bcl-2 / BclxL-Inhibitor, 2-MA A3, von dem gezeigt wurde, dass er Apoptose induziert [42]. Tumorzellen wurden puma 39 mit Iressa allein (0-100 uM), 2-MA A3 allein (0-100 uM) und in Kombination in einem Molverhältnis von 1: 2 (Iressa: 2-MA A3) behandelt.
EGFR-STAT3-Wechselwirkungen führen zur Transkriptionsaktivierung mehrerer krebsrelevanter Gene, darunter induzierbare Stickoxidsynthase [34], TWIST [48] und COX-2 [49]. Es wurde gezeigt, dass EGFR mit dem Natrium / Glucose-Cotransporter 1 interagiert und diesen stabilisiert, was zur Aufrechterhaltung des intrazellulären Glucosespiegels und zur Verhinderung des autophagischen Zelltods führt [50] und an das humane GSTP1-Protein bindet und dieses phosphoryliert [51]. Interessanterweise wurde gezeigt, dass der Tumorsuppressor p53 auf die Mitochondrien transloziert und [img]http://www.keksa.de/images/ance/puma 39-371beu.jpg[/img] an das anti-apoptotische Bcl-xL bindet, was zur Apoptose führt [52]. |
|
